Javascript è attualmente disabilitato nel tuo browser.Diverse funzionalità di questo sito non funzioneranno mentre javascript è disabilitato.accesso aperto alla ricerca scientifica e medicaDalla presentazione alla prima decisione editoriale.Dall'accettazione editoriale alla pubblicazione.La suddetta percentuale di manoscritti è stata respinta negli ultimi 12 mesi.Riviste scientifiche e mediche peer-reviewed ad accesso libero.Dove Medical Press è membro dell'OAI.Ristampe in blocco per l'industria farmaceutica.Offriamo vantaggi reali ai nostri autori, inclusa l'elaborazione accelerata degli articoli.Registra i tuoi dettagli specifici e farmaci specifici di interesse e abbineremo le informazioni fornite agli articoli dal nostro ampio database e ti invieremo prontamente copie PDF via e-mail.Torna a Diari » Journal of Inflammation Research » Volume 15Autori Li M, Xu J, Wang Y, Du X, Zhang T, Chen YPubblicato il 20 maggio 2022 Volume 2022:15 Pagine 2995—3020DOI https://doi.org/10.2147/JIR.S362401Revisione tramite revisione tra pari anonima singolaEditore che ha approvato la pubblicazione: Dr Adam BachstetterMei Li,1 Jing Xu,1,2 Yujue Wang,1 Xiaoye Du,1,2 Teng Zhang,1,2 Yu Chen1– 3 1Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai, 200427 , Repubblica Popolare Cinese;2Clinical Research Institute of Integrative Medicine, Shanghai Academy of Traditional Chinese Medicine, Shanghai, 200437, People's Republic of China;3Laboratory of Clinical and Molecular Pharmacology, Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai, 200427, People's Republic of China Corrispondenza: Yu Chen, Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Shanghai University of Medicina tradizionale cinese, 110 Ganhe Road, Shanghai, 200437, Repubblica popolare cinese, Tel +86 21 5598 1009, Fax +86 21 5598 1009, Email [e-mail protetta] Scopo: i fotorecettori sono neuroni retinici specializzati responsabili della fototrasduzione.La perdita dei fotorecettori porta direttamente a una compromissione irreversibile della vista.Le terapie farmacologiche che proteggono dalla degenerazione dei fotorecettori sono clinicamente carenti.Lo stress ossidativo e l'infiammazione sono meccanismi comuni che giocano un ruolo importante nella patogenesi della degenerazione dei fotorecettori.L'astragaloside A (AS-A) è un agente antiossidante e antinfiammatorio naturale con attività neuroprotettiva.Tuttavia, gli effetti protettivi dei fotorecettori di AS-A rimangono sconosciuti.Il presente studio mira quindi a illustrare le potenzialità farmacologiche di AS-A nella protezione contro la degenerazione dei fotorecettori.Metodi: i topi BALB/c e C57/BL6J sono stati esposti a luce intensa e agente alchilante del DNA metil metansolfonato (MMS) per sviluppare rispettivamente lo stress ossidativo e la degenerazione dei fotorecettori mediata dal danno del DNA.Sono state eseguite valutazioni microstrutturali, morfologiche e funzionali per valutare direttamente gli effetti protettivi dei fotorecettori di AS-A.Sono stati esaminati i cambiamenti ultrastrutturali e molecolari nella retina per comprendere meglio i meccanismi farmacologici dell'AS-A nella protezione contro la degenerazione dei fotorecettori.Risultati: AS-A protetto contro la compromissione dei fotorecettori indotta dalla luce intensa.Lo stress ossidativo retinico indotto dalla luce intensa e la morte delle cellule dei fotorecettori sono stati attenuati dal trattamento con AS-A.Il trattamento AS-A ha mitigato il danno al DNA indotto dalla luce intensa, l'attivazione della poli (ADP-ribosio) polimerasi (PARP) e la dislocazione nucleare del gruppo ad alta mobilità box 1 (HMGB1) nei fotorecettori.AS-A ha ampiamente contrastato i profili di espressione genica della retina alterati dalla luce brillante.In particolare, AS-A ha ridotto l'espressione retinica dei geni coinvolti nella necroptosi e nelle risposte infiammatorie.Anche l'attivazione della microglia indotta dalla luce intensa è stata soppressa a seguito del trattamento con AS-A.Inoltre, AS-A ha attenuato il deterioramento morfologico dei fotorecettori indotti dall'MMS, l'elevata espressione di geni pro-necroptotici e proinfiammatori nonché l'attivazione della microglia nella retina.Conclusione: il lavoro qui dimostra per la prima volta che AS-A protegge dalla degenerazione dei fotorecettori in parte attenuando lo stress ossidativo e la necroptosi indotta dal danno al DNA e le risposte infiammatorie nella retina.Parole chiave: degenerazione retinica, stress fotoossidativo, protezione dei fotorecettori, morte cellulare programmata, attivazione microglialeI fotorecettori sono i neuroni retinici di primo ordine che svolgono funzioni di rilevamento della luce e di fototrasduzione, svolgendo un ruolo essenziale nell'iniziare la visione.1 La degenerazione dei fotorecettori è responsabile di una compromissione irreversibile e progressiva della vista nei pazienti con degenerazione maculare legata all'età (AMD) e retiniche ereditarie degenerazione come la retinite pigmentosa.2,3 Numerose terapie sono state valutate in studi clinici e si sono dimostrate inefficaci o inconcludenti per quanto riguarda l'efficacia nel prevenire la perdita di fotorecettori nell'AMD secca.Sono inoltre disponibili studi clinici in corso per il trattamento dell'AMD secca.Tuttavia, adeguate terapie protettive dei fotorecettori non sono state ufficialmente approvate per l'uso clinico per prevenire o ritardare la progressione della degenerazione dei fotorecettori.4I disturbi degenerativi dei fotorecettori possono essere causati da mutazioni nei geni funzionali, insulti ambientali o una combinazione di fattori genetici e ambientali.Indipendentemente dalle eziologie, la morte cellulare programmata innescata dallo stress ossidativo è un meccanismo comune alla base della perdita dei fotorecettori.5 Inoltre, la degenerazione dei fotorecettori è spesso accompagnata e ulteriormente aggravata da risposte infiammatorie eccessive principalmente mediate dalle cellule microgliali attivate.6 Pertanto, la soppressione delle cellule fotorecettrici la morte e l'attenuazione dell'infiammazione retinica sono ugualmente importanti nella gestione terapeutica della degenerazione dei fotorecettori.L'astragaloside A (AS-A), una saponina triterpenoide nota anche come astragaloside IV, è il principale componente chimico dell'Astragalus membranaceus, un medicinale a base di erbe con un'ampia gamma di effetti terapeutici, comprese le proprietà di miglioramento della vista nella medicina tradizionale cinese.7 Nel frattempo, farmacologico studi hanno dimostrato che le attività antiossidanti e antinfiammatorie dell'AS-A contribuiscono agli effetti neuroprotettivi dell'AS-A osservati in modelli sperimentali di morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson e ischemia cerebrale.7,8 Tuttavia, se l'AS-A è farmacologicamente attivo in Resta da chiarire l'attenuazione della degenerazione dei fotorecettori mediata dallo stress ossidativo e dell'infiammazione retinica associata.Pertanto, nel lavoro in corso, abbiamo testato l'ipotesi che AS-IV possa proteggere dalla degenerazione dei fotorecettori alleviando lo stress ossidativo e l'infiammazione nella retina.AS-A (purezza>98%, Cat. No. B10462) è stato acquistato da Shanghai Shifeng Biological Technology Co., Ltd (Cina).Il metil metansolfonato (MMS) (n. cat. 129925) è stato ordinato da Sigma-Aldrich (USA).Sono stati acquistati topi BALB/c (femmina, 4–5 settimane di età, peso corporeo in media a 20±2 g), topi C57BL/6J (maschio, 6–8 settimane di età, peso corporeo in media a 22±2 g) da Shanghai Laboratory Animal Research Center (Cina).I topi sono stati alloggiati in condizioni di illuminazione controllata (ciclo luce/buio di 12/12 ore), temperatura (20±2°C) e umidità (35-55%) con accesso a cibo e acqua ad libitum.Gli studi sugli animali inclusi in questo lavoro sono stati esaminati e approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali, Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (approvazione n. YYLAC-2019-021-2).Le procedure di manipolazione degli animali sono state eseguite seguendo la Dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva.Per esperimenti che coinvolgono l'esposizione alla luce intensa, i topi BALB/c adattati al buio per 3 giorni sono stati esposti a luce bianca (LED Floodlight, 30 W, PHILIPS) erogata a 15.000 lux per 30 minuti senza dilatazione delle pupille.Per gli esami della struttura retinica e della morfologia dei fotorecettori, AS-A (disciolto in DMSO al 30% in soluzione salina allo 0,9%) è stato somministrato a 6,25 mg/kg di peso corporeo (p.c.), 25 mg/kg p.c. e 100 mg/kg p.c. 30 min prima dell'esposizione alla luce tramite iniezione intraperitoneale.Per il resto degli esperimenti, AS-A è stato somministrato a 100 mg/kg di peso corporeo 30 minuti prima dell'esposizione alla luce tramite iniezione intraperitoneale.I topi non esposti alla luce indicata e i topi esposti alla luce senza trattamento AS-A hanno ricevuto il trattamento del veicolo (30% DMSO in soluzione salina allo 0,9%) nello stesso modo.Per gli esperimenti che coinvolgono la somministrazione di MMS, i topi C57BL/6J hanno ricevuto un'iniezione intraperitoneale con MMS (sciolto in una soluzione salina allo 0,9%) alla dose di 55 mg/kg di peso corporeo (p.c.).I topi sfidati dall'MMS hanno ricevuto un trattamento con veicolo (soluzione salina allo 0,9%) o AS-A a 100 mg/kg di peso corporeo tramite iniezione intraperitoneale due volte al giorno fino al termine dell'esperimento per le analisi indicate.I topi C57/BL6J senza iniezione di MMS sono stati trattati con una soluzione salina allo 0,9% per fungere da controlli normali trattati con il veicolo.L'OCT guidato dalle immagini (OCT 2 con Micron IV, Phoenix Research Labs, USA) è stato adottato per scansionare la struttura retinica come descritto in precedenza.9 In breve, iniezione intraperitoneale di ketamina cloridrato (82,5 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (8,25 mg/kg di peso corporeo) bw) è stato eseguito per indurre l'anestesia nei topi soggetti a imaging OCT, seguita da dilatazione delle pupille utilizzando tropicamide all'1%.Da cinque a dieci scansioni retiniche complete sono state acquisite e mediate utilizzando il software Phoenix Reveal OCT (Phoenix Research labs, USA).L'ERG è stato registrato sotto una debole luce rossa e analizzato con il test universale e il sistema elettrofisiologico di Ganzfeld (Phoenix Research labs, USA) come descritto in precedenza.9 In breve, i topi adattati al buio sono stati anestetizzati con una miscela di ketamina cloridrato (82,5 mg/kg di peso corporeo). ) e xilazina (8,25 mg/kg di peso corporeo).Gli ERG scotopici sono stati generati con lampi di luce verde a intensità che vanno da -2 log cd.sm-2 a 3,1 log cd.sm-2.Per l'esame istologico della morfologia retinica grossolana, i bulbi oculari enucleati sono stati fissati in paraformaldeide al 4% per 24 ore, seguiti dall'elaborazione dei tessuti per l'inclusione di paraffina.Le sezioni di paraffina sono state quindi tagliate a 4 μm e colorate con ematossilina ed eosina (HE).Ai fini dell'IHC, le sezioni di paraffina sono state incubate con anticorpi primari tra cui anti-rodopsina di topo (1:1000, NBP2-25160, Novus, USA), anti-M-opsina di coniglio (1:100, AB5405, Millipore, USA), anti-coniglio -S-opsina (1:100, AB5407, Millipore, USA), coniglio anti-protein chinasi Cα (PKCα) (1:5000, P4334, Sigma-Aldrich, USA), coniglio anti-calbindina D (1:1000, ab11426 , Abcam, USA), coniglio anti-alta mobilità gruppo proteina box 1 (HMGB1) (1:1000, ab18256, Abcam, USA), coniglio anti-gamma H2A.X (γH2AX) (fosfo S139) (1:1000, ab81299 , Abcam, USA), coniglio anti-SOD2 (1:500, D3X8F, Cell Signaling Technology, USA), coniglio anti-glutatione perossidasi 4 (GPX4) (1:200, ab125066, Abcam, USA), coniglio anti-fagotto ( 1:200, D63B6, Abcam, USA), proteina anti-shock termico di coniglio 60 (HSP60) (1:200, ab46789, Abcam, USA), mouse anti-Lamin B1 (1:500, sc-374015, Santa Cruz, STATI UNITI D'AMERICA).Sono state inoltre preparate criosezioni per la valutazione dell'IHC.In breve, le conchiglie oculari sono state sezionate senza cornea e cristallino, fissate in paraformaldeide al 4% per 30 minuti a temperatura ambiente e processate per la criosezione.Le criosezioni dello spessore di 12 μm sono state quindi incubate con gli anticorpi primari indicati, inclusa la molecola adattatore di legame del calcio anti-ionizzato 1 (Iba1) (1:500, 019–19741, FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Giappone) e anti-poli di topo ( ADP-ribosio) (PAR) (1:1000, ALX-804-220-R100, Enzo Life Sciences, USA).Gli anticorpi secondari utilizzati per gli esami IHC includevano anticorpi anti-topo di pecora coniugati con Cy3 (1: 1000, C2181, Sigma-Aldrich, USA), anticorpi anti-coniglio di pecora coniugati con Cy3 (1: 1000, C2036, Sigma-Aldrich, USA) e anticorpo anti-coniglio coniugato con Alexa Fluor 488 (1:500, ab150073, Abcam, USA).La controcolorazione nucleare è stata eseguita utilizzando 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (D8200, ROCHE, USA).Dopo la colorazione HE, la morfologia retinica è stata esaminata e registrata da un microscopio ottico (DM2000, Leica, Germania).Dopo gli esami IHC indicati, le immagini sono state osservate e registrate utilizzando un microscopio a fluorescenza (DM6000B, Leica, Germania).Il software Leica LAS AF è stato utilizzato per acquisire immagini a fluorescenza.Il guadagno della fotocamera e il tempo di esposizione per ciascuna colorazione indicata sono stati mantenuti gli stessi in tutti i gruppi sperimentali.L'immunopositività dell'immunocolorazione indicata è stata analizzata utilizzando ImageJ.Per ciascuna sezione sono state ottenute almeno quattro immagini della retina superiore, inferiore e centrale.I bulbi oculari sono stati rapidamente rimossi e fissati in tampone glutaraldeide fosfato al 2,5% pre-raffreddato a 4°C per 2 ore.La lente e la cornea sono state quindi rimosse dai bulbi oculari per creare conchiglie oculari.Le conchiglie oculari sul lato temporale del disco ottico sono state tagliate in strisce delle dimensioni di circa 1 mm × 2 mm, seguite da fissazione in tampone glutaraldeide fosfato pre-raffreddato al 2,5% a 4°C durante la notte.Le strisce di tessuto sono state quindi risciacquate in PBS, fissate con tetrossido di osmio all'1% a 4°C per 2 ore, disidratate, colorate in blocco con acetato di uranile al 3% e incorporate in EPON.Le sezioni ultrasottili sono state realizzate utilizzando un ultramicrotomo (Leica EM UC7, Leica Microsystems, Germania) e colorate con citrato di piombo.L'ultrastruttura della retina è stata quindi osservata utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione (H-7650, Hitachi, Giappone).Il rilevamento in situ della formazione di superossido è stato eseguito come descritto in precedenza.9,10 In breve, la sonda di superossido diidroetidio (DHE) (Sigma-Aldrich, USA) è stata somministrata per via intraperitoneale alla dose di 20 mg/kg di peso corporeo.Le conchiglie oculari sono state realizzate 2 ore dopo la somministrazione di DHE e fissate in paraformaldeide al 4% per 30 minuti, seguite dall'elaborazione per la criosezione.Le criosezioni di 12 μm di spessore sono state controcolorate con DAPI e riprese mediante un microscopio a fluorescenza (DM6000B, Leica, Germania).Almeno 4 immagini di fluorescenza sono state acquisite dalla retina superiore, inferiore e centrale di ciascuna sezione utilizzando il software Leica LAS AF con lo stesso guadagno della fotocamera e configurazione dell'esposizione per tutti i gruppi sperimentali.La positività del DHE è stata analizzata utilizzando ImageJ.Il rilevamento in situ della morte cellulare nella retina è stato eseguito mediante un test TUNEL.Le sezioni di paraffina ottenute dagli occhi enucleati dopo i trattamenti indicati sono state sottoposte a valutazione TUNEL secondo le istruzioni del produttore (sistema TUNEL Fluorometrico DeadEnd™, Promega, USA).Le immagini sono state osservate utilizzando un microscopio a fluorescenza (DM6000B, Leica, Germania).Almeno 4 immagini di fluorescenza sono state catturate dalla retina superiore, inferiore e centrale di ciascuna sezione utilizzando il software Leica LAS AF.Il guadagno della fotocamera e il tempo di esposizione sono stati mantenuti gli stessi per tutti i gruppi sperimentali.La positività TUNEL è stata analizzata utilizzando ImageJ.L'RNA totale è stato isolato dalla retina del topo utilizzando un kit di isolamento mirVana miRNA (Thermo Fisher Scientific, USA) seguendo i protocolli del produttore.La purezza e la quantità di RNA sono state valutate utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, USA).L'integrità dell'RNA è stata valutata utilizzando un bioanalizzatore Agilent 2100 (Agilent Technologies, USA).Le librerie di cDNA sono state costruite utilizzando un TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit (Illumina, San Diego, CA, USA) seguendo le istruzioni del produttore.Le librerie sono state sequenziate su una piattaforma Illumina NovaSeq 6000.I dati grezzi nel formato fastq sono stati elaborati utilizzando Trimmomatic11 e le letture di bassa qualità sono state rimosse.Le letture pulite sono state quindi mappate sul genoma di riferimento utilizzando hisat2.12 Il valore FPKM di ciascun gene è stato calcolato utilizzando i gemelli13 e i conteggi delle letture di ciascun gene sono stati ottenuti mediante htseq-count.14 La distribuzione e la variazione dei campioni sono state valutate mediante l'analisi delle componenti principali ( PCA).I geni differenzialmente espressi (DEG) sono stati identificati utilizzando le funzioni del pacchetto DESeq2 R stimaSizeFactors e nbinomTest.15 L'espressione significativamente differenziale è stata definita come valore P<0,05 e cambiamento di piega>1,5.L'analisi dei cluster gerarchici dei DEG è stata eseguita per dimostrare il modello di espressione dei geni nei gruppi di trattamento indicati.Per eseguire l'analisi dell'arricchimento funzionale, l'analisi dell'arricchimento del set genico (GSEA) basata su Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) e sui set di geni Gene Ontology (GO) è stata eseguita utilizzando il pacchetto ClusterProfiler R e il pacchetto di annotazioni org.Mm.eg.db .16 I set di geni con valore assoluto del punteggio di arricchimento normalizzato (NES)>1 e valore q del tasso di falsa scoperta (FDR) <0,05 sono stati considerati significativamente arricchiti.Il relativo valore q FDR è stato corretto utilizzando la procedura Benjamini-Hochberg.L'RNA totale è stato isolato dalla retina del topo utilizzando il reagente TRIzol (Invitrogen, USA), seguito da trascrizione inversa utilizzando PrimeScript RT Master Mix (TaKaRa, Giappone).L'espressione dell'mRNA di Ccl2, Ccl3, Ccl4, Cd68, Fas, Il1b, Mlkl, Ripk1, Ripk3, Tlr2, Tlr4, Tnf, Tspo e Zbp1 è stata analizzata utilizzando LightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche, Germania) su un LightCycler 480 II sistema (Roche, USA).18s rRNA è stato analizzato in parallelo per scopi di normalizzazione.Le sequenze di primer sono state incluse nella tabella supplementare 1. Il cambiamento di piega nell'espressione genica è stato calcolato secondo 2 -[Ct (candidato) -Ct (18s rRNA)].I dati sono stati presentati come media ± errore standard della media (SEM).Le analisi statistiche sono state eseguite dal test t di Student o dall'ANOVA unidirezionale con il test di confronto multiplo della Turchia.La significatività statistica è stata definita come P<0,05.Lo stress ossidativo è un meccanismo centrale che media la degenerazione dei fotorecettori.L'esposizione alla luce intensa induce stress fotoossidativo nei fotorecettori ed è comunemente adottata per ricapitolare sperimentalmente le patologie degenerative dei fotorecettori in vivo.17 Per valutare direttamente le proprietà protettive dei fotorecettori di AS-A, l'esposizione alla luce intensa è stata applicata ai topi BALB/c per indurre lo stress fotoossidativo mediato degenerazione dei fotorecettori.AS-A è stato somministrato ai topi esposti alla luce alle dosi di 6,25 mg/kg di peso corporeo, 25 mg/kg di peso corporeo e 100 mg/kg di peso corporeo.I topi trattati con il veicolo con e senza esposizione alla luce intensa sono serviti rispettivamente come veicolo e controlli normali.L'imaging OCT è stato eseguito per ottenere scansioni della sezione trasversale retinica completa per la valutazione imparziale della microstruttura retinica.Come mostrato nella Figura 1A, la microstruttura dei fotorecettori tra cui lo strato nucleare esterno (ONL), il segmento esterno (OS) e il segmento interno (IS) è stata gravemente compromessa nei topi trattati con veicoli esposti alla luce, mentre la microstruttura della retina interna è rimasta in gran parte inalterato.Una parziale conservazione della microstruttura dei fotorecettori nella retina inferiore e superiore è stata osservata quando AS-A è stato somministrato a 6,25 e 25 mg/kg di peso corporeo.Una protezione quasi completa della microstruttura dei fotorecettori è stata osservata sia nella retina inferiore che in quella superiore nei topi esposti alla luce trattati con 100 mg/kg di peso corporeo AS-A.La misurazione dello spessore di ONL e OS/IS nella retina superiore (Figura 1B) e inferiore (Figura 1C) ha mostrato costantemente che ONL e OS/IS erano molto più sottili nella retina trattata con il veicolo esposta alla luce rispetto a quella del controlli normali, mentre il trattamento AS-A ha provocato ONL e OS/IS significativamente più spessi rispetto a quello delle retine trattate con veicolo esposto alla luce (Figura 1B e C).La figura 1 AS-A protegge dal danno microstrutturale indotto dalla luce intensa dei fotorecettori.Il veicolo (LD) o AS-A è stato somministrato 30 minuti prima di esporre i topi BALB/c adattati al buio alla luce bianca a 15.000 lux per 30 minuti.AS-A è stato somministrato a 6,25 mg/kg pc (AS-A_6,25), 25 mg/kg pc (AS-A_25) e 100 mg/kg pc (AS-A_100).I topi BALB/c adattati al buio senza l'esposizione alla luce indicata hanno ricevuto il trattamento del veicolo nello stesso modo (NL).(A) Sette giorni dopo l'esposizione alla luce, è stata eseguita l'imaging OCT per scansionare la microstruttura retinica.(B e C) Lo spessore di ONL e IS/OS è stato misurato a 500 μm dall'ONH rispettivamente nella retina superiore e inferiore.L'asterisco bianco e il triangolo chiuso indicano rispettivamente ONL e IS/OS compromessi.I dati sono stati espressi come media ± SEM (n = 4-6 per gruppo).### Rispetto a quello di NL, P<0,001;*** rispetto a quello di LD, P<0,001.Abbreviazioni: ELM, membrana limitante esterna (linea verde);INL, strato nucleare interno;IS, segmento interno;ONL, strato nucleare esterno;OPL, strato plessiforme esterno (linea rossa);OS, segmento esterno;RPE, epitelio pigmentato retinico (linea blu).La figura 1 AS-A protegge dal danno microstrutturale indotto dalla luce intensa dei fotorecettori.Il veicolo (LD) o AS-A è stato somministrato 30 minuti prima di esporre i topi BALB/c adattati al buio alla luce bianca a 15.000 lux per 30 minuti.AS-A è stato somministrato a 6,25 mg/kg pc (AS-A_6,25), 25 mg/kg pc (AS-A_25) e 100 mg/kg pc (AS-A_100).I topi BALB/c adattati al buio senza l'esposizione alla luce indicata hanno ricevuto il trattamento del veicolo nello stesso modo (NL).(A) Sette giorni dopo l'esposizione alla luce, è stata eseguita l'imaging OCT per scansionare la microstruttura retinica.(B e C) Lo spessore di ONL e IS/OS è stato misurato a 500 μm dall'ONH rispettivamente nella retina superiore e inferiore.L'asterisco bianco e il triangolo chiuso indicano rispettivamente ONL e IS/OS compromessi.I dati sono stati espressi come media ± SEM (n = 4-6 per gruppo).### Rispetto a quello di NL, P<0,001;*** rispetto a quello di LD, P<0,001.Abbreviazioni: ELM, membrana limitante esterna (linea verde);INL, strato nucleare interno;IS, segmento interno;ONL, strato nucleare esterno;OPL, strato plessiforme esterno (linea rossa);OS, segmento esterno;RPE, epitelio pigmentato retinico (linea blu).La valutazione istologica è stata ulteriormente eseguita per esaminare in dettaglio i cambiamenti morfologici della retina.Come mostrato nella Figura 2A, in netto contrasto con la morfologia intatta di OS e IS osservata nei controlli normali, OS e IS erano quasi non rilevabili nelle retine trattate con veicolo esposto alla luce.L'ONL è stato organizzato in 11-13 file di nuclei di fotorecettori ben allineati nei controlli normali, mentre solo 2-3 file di nuclei di fotorecettori sono rimaste nelle retine trattate con il veicolo esposto alla luce.Tuttavia, nei topi esposti alla luce trattati con 100 mg/kg di peso corporeo AS-A, la morfologia di OS, IS e ONL era ben conservata.Nei topi esposti alla luce trattati con 6,25 e 25 mg/kg di peso corporeo AS-A, nelle retine inferiori è stata osservata una migliore morfologia di OS, IS e ONL, in particolare quella di IS e ONL.Nel frattempo, rispetto a quello dei topi trattati con veicolo esposto alla luce, il numero di nuclei di fotorecettori è stato significativamente aumentato sia nella retina superiore (Figura 2B) che in quella inferiore (Figura 2C) nei topi esposti alla luce trattati con AS-A a tutte le dosiI risultati dell'imaging OCT e della valutazione istologica dimostrano collettivamente che il trattamento AS-A è efficace nel proteggere i fotorecettori dallo sviluppo di degenerazione microstrutturale e morfologica indotta da stress fotoossidativo.La figura 2 AS-A protegge dalla compromissione morfologica dei fotorecettori indotta dalla luce intensa.Gli occhi sono stati enucleati dai gruppi di trattamento indicati 7 giorni dopo l'esposizione a luce intensa.(A) L'esame istologico è stato eseguito mediante colorazione HE.Sono state presentate micrografie rappresentative prelevate dalle retine centrali.(B e C) Il numero di file di nuclei in ONL è stato misurato rispettivamente nella retina superiore e inferiore.L'asterisco bianco e il triangolo chiuso indicano rispettivamente ONL e IS/OS diminuiti.I dati sono stati espressi come media ± SEM (n = 4 per gruppo).### Rispetto a quello di NL, P<0,001;** rispetto a quello di LD, P<0,01;*** rispetto a quello di LD, P<0,001.Abbreviazioni: INL, strato nucleare interno;IS, segmento interno;ONL, strato nucleare esterno;OPL, strato plessiforme esterno;OS, segmento esterno;RPE, epitelio pigmentato retinico.La figura 2 AS-A protegge dalla compromissione morfologica dei fotorecettori indotta dalla luce intensa.Gli occhi sono stati enucleati dai gruppi di trattamento indicati 7 giorni dopo l'esposizione a luce intensa.(A) L'esame istologico è stato eseguito mediante colorazione HE.Sono state presentate micrografie rappresentative prelevate dalle retine centrali.(B e C) Il numero di file di nuclei in ONL è stato misurato rispettivamente nella retina superiore e inferiore.L'asterisco bianco e il triangolo chiuso indicano rispettivamente ONL e IS/OS diminuiti.I dati sono stati espressi come media ± SEM (n = 4 per gruppo).### Rispetto a quello di NL, P<0,001;** rispetto a quello di LD, P<0,01;*** rispetto a quello di LD, P<0,001.Abbreviazioni: INL, strato nucleare interno;IS, segmento interno;ONL, strato nucleare esterno;OPL, strato plessiforme esterno;OS, segmento esterno;RPE, epitelio pigmentato retinico.Successivamente, è stato eseguito l'ERG per valutare il significato farmacologico di AS-A nella protezione contro il deterioramento della funzione retinica indotto dallo stress fotoossidativo.Dato che è stata osservata una protezione quasi completa della microstruttura e della morfologia dei fotorecettori quando AS-A è stato somministrato a 100 mg/kg di peso corporeo (Figure 1 e 2), i topi BALB/c esposti alla luce sono stati trattati con veicolo o AS-A a 100 mg/kg di peso corporeo in un esperimento indipendente, seguito dall'analisi ERG dell'onda a scotopica (Figura 3A e B) e dell'onda b (Figura 3A e C).I risultati hanno mostrato che, contrariamente alle risposte ERG distinte degli aumenti dipendenti dall'intensità della luce nelle ampiezze dell'onda a e dell'onda b manifestate dai controlli normali, gli aumenti dipendenti dall'intensità della luce nelle ampiezze dell'onda a e b sono stati notevolmente smorzati nei topi trattati con veicolo esposti alla luce.Tuttavia, risposte ERG simili a quelle osservate nei controlli normali sono state registrate nei topi trattati con AS-A esposti alla luce, che hanno mostrato ampiezze delle onde a e b significativamente aumentate rispetto a quelle dei topi trattati con veicoli esposti alla luce .Pertanto, i risultati della registrazione ERG dimostrano che AS-A è efficace nel preservare la funzione retinica in condizioni di stress fotoossidativo.La figura 3 AS-A protegge dalla compromissione della funzione retinica indotta dalla luce intensa.I topi BALB/c adattati al buio sono stati trattati con veicolo (LD) o AS-A a 100 mg/kg di peso corporeo (AS-A) 30 minuti prima dell'esposizione alla luce.I topi BALB/c adattati al buio non esposti all'esposizione alla luce intensa hanno ricevuto il trattamento del veicolo (NL).Scotopic ERG è stato eseguito per valutare la funzione retinica 7 giorni dopo i trattamenti indicati.(A) Sono stati presentati elettroretinogrammi rappresentativi.(B e C) Sono state tracciate le ampiezze dell'onda a e dell'onda b.I dati sono stati espressi come media ± SEM (n = 5 per gruppo).### Rispetto a quello di NL, P<0,001;* rispetto a quello di LD, P<0,05;*** rispetto a quello di LD, P<0,001.La figura 3 AS-A protegge dalla compromissione della funzione retinica indotta dalla luce intensa.I topi BALB/c adattati al buio sono stati trattati con veicolo (LD) o AS-A a 100 mg/kg di peso corporeo (AS-A) 30 minuti prima dell'esposizione alla luce.I topi BALB/c adattati al buio non esposti all'esposizione alla luce intensa hanno ricevuto il trattamento del veicolo (NL).Scotopic ERG è stato eseguito per valutare la funzione retinica 7 giorni dopo i trattamenti indicati.(A) Sono stati presentati elettroretinogrammi rappresentativi.(B e C) Sono state tracciate le ampiezze dell'onda a e dell'onda b.I dati sono stati espressi come media ± SEM (n = 5 per gruppo).### Rispetto a quello di NL, P<0,001;* rispetto a quello di LD, P<0,05;*** rispetto a quello di LD, P<0,001.Il nostro lavoro precedente ha dimostrato che oltre a innescare la perdita di fotorecettori, lo stress fotoossidativo provoca anche un deterioramento morfologico dei neuroni retinici di secondo ordine come le cellule bipolari e le cellule orizzontali, che possono contribuire collettivamente al deterioramento della funzione retinica.18-22 La rodopsina, la M-opsina e la S-opsina sono proteine ​​funzionali che marcano rispettivamente i fotorecettori a bastoncello, a lunghezza d'onda media e a cono a lunghezza d'onda corta.Le cellule bipolari e le cellule orizzontali sono rispettivamente positive per PKCα e calbindina D.Pertanto, l'esame IHC è stato ulteriormente eseguito per visualizzare l'impatto del trattamento AS-A sull'integrità morfologica dei fotorecettori dei bastoncelli, dei fotorecettori dei coni, nonché delle cellule bipolari e delle cellule orizzontali.Come mostrato nelle Figure 4A e B, l'abbondante espressione di rodopsina è stata prontamente rilevata nell'OS nei controlli normali, mentre l'espressione di rodopsina è stata notevolmente ridotta nelle retine trattate con veicolo esposto alla luce.Anche l'espressione di M-opsina (Figura 4C e D) e S-opsina (Figura 4E e F) è stata ridotta nella retina trattata con veicolo esposta alla luce rispetto a quella dei controlli normali.Al contrario, l'espressione di rodopsina, M-opsina e S-opsina nelle retine trattate con AS-A esposte alla luce è risultata a livelli simili a quelli osservati nei controlli normali (Figura 4A-F).Inoltre, l'esame IHC ha rivelato una marcata riduzione dei livelli di PKCα (Figura 5A e B) e calbindina D (Figura 5C e D) nello strato plessiforme esterno (OPL) nelle retine trattate con veicolo esposte alla luce rispetto a quella del controlli normali, indicativi rispettivamente della compromissione dei dendriti delle cellule bipolari e dei terminali assonali delle cellule orizzontali.Tuttavia, è stata osservata una maggiore immunopositività di PKCα e calbindina D nell'OPL nelle retine trattate con AS-A esposte alla luce (Figura 5A-D).I risultati qui dimostrano collettivamente che il trattamento AS-A preserva l'integrità morfologica dei fotorecettori a bastoncello e cono, nonché i neuroni retinici di secondo ordine in condizioni di stress fotoossidativo.La figura 4 AS-A protegge dall'obliterazione indotta dalla luce intensa dei fotorecettori a coni e bastoncelli.Gli occhi sono stati enucleati dai gruppi di trattamento indicati 7 giorni dopo l'esposizione a luce intensa.(A, C, E) È stato eseguito l'esame IHC di rodopsina (A), M-opsina (C) e S-opsina (E) (in rosso).DAPI è stato contrastato per visualizzare i nuclei (in blu).(B, D, F) L'immunopositività di rodopsina (B), M-opsina (D) e S-opsina (F) è stata quantificata utilizzando ImageJ e presentata come immunopositività relativa rispetto a quella di NL.L'asterisco bianco indica l'ONL danneggiato.I dati sono stati espressi come media ± SEM (n = 4-6 per gruppo).### Rispetto a quello di NL, P<0,001;*** rispetto a quello di LD, P<0,001.Abbreviazioni: INL, strato nucleare interno;ONL, strato nucleare esterno.La figura 5 AS-A protegge dal deterioramento morfologico indotto dalla luce brillante delle cellule bipolari e orizzontali.Gli occhi sono stati enucleati dai gruppi di trattamento indicati 7 giorni dopo l'esposizione a luce intensa.(A e C) IHC è stato eseguito per esaminare l'espressione retinica di PKCα (A) e calbindina D (C) (in rosso).DAPI (in blu) è stato contrastato.(B e D) L'immunopositività di PKCα e calbindina D nell'OPL è stata quantificata utilizzando ImageJ e presentata come l'immunopositività relativa rispetto a quella di NL.La freccia bianca indica dendriti alterati delle cellule bipolari (A) e terminali assonali ridotti delle cellule orizzontali (C).I dati sono stati espressi come media ± SEM (n = 4 per gruppo).## Rispetto a quello di NL, P<0,01;### rispetto a quello di NL, P<0,001;** rispetto a quello di LD, P<0,01;*** rispetto a quello di LD, P<0,001.Abbreviazioni: INL, strato nucleare interno;ONL, strato nucleare esterno;OPL, strato plessiforme esterno.La figura 4 AS-A protegge dall'obliterazione indotta dalla luce intensa dei fotorecettori a coni e bastoncelli.Gli occhi sono stati enucleati dai gruppi di trattamento indicati 7 giorni dopo l'esposizione a luce intensa.(A, C, E) È stato eseguito l'esame IHC di rodopsina (A), M-opsina (C) e S-opsina (E) (in rosso).DAPI è stato contrastato per visualizzare i nuclei (in blu).(B, D, F) L'immunopositività di rodopsina (B), M-opsina (D) e S-opsina (F) è stata quantificata utilizzando ImageJ e presentata come immunopositività relativa rispetto a quella di NL.L'asterisco bianco indica l'ONL danneggiato.I dati sono stati espressi come media ± SEM (n = 4-6 per gruppo).### Rispetto a quello di NL, P<0,001;FDR, tasso di false scoperte;IHC, immunoistochimica;Gli autori non segnalano conflitti di interesse in questo lavoro.J Cell Sci.Investi Oftalmolo Vis Sci.Nat Rev Genet.Occhio.Curr Neurofarmaco.J Neuroinfiammazione.J Biol Chem.Bioinformatica.Metodi Nat.Biotecnologie naturali.Bioinformatica.Genoma Biol.Elife.Exp Eye Res.Investi Oftalmolo Vis Sci.Arch Gerontol Geriatr.Occhio.Natura.Immunolo anteriore.Nat Rev Immunol.vivo.J Biol Chem.Metodi Cellula Biol.Investi Oftalmolo Vis Sci.Surv Oftalmolo.Mol Vis.Arco Oftalmolo.J Biol Chem.Nat Genet.Natura.J Neurosci.J Neuroinfiammazione.Neurosci anteriori.Natura.Epatologia.PLoS Genet.Le opinioni espresse in tutti gli articoli qui pubblicati sono quelle degli autori specifici e non riflettono necessariamente le opinioni di Dove Medical Press Ltd o dei suoi dipendenti.Tutti i diritti riservati.Registrato in Inghilterra e Galles.Se accetti il ​​nostro utilizzo dei cookie e il contenuto della nostra Informativa sulla privacy, fai clic su "accetta".